琼脂糖凝胶电泳常见问题及解决方案全解析

琼脂糖凝胶电泳常见问题及解决方案全解析

DNA 凝胶电泳简介

一、实验原理

1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：适合分离 1kb 以下的片段，最高分辨率可达 1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中常用该凝胶进行纯化，也称 PAGE 纯化。
2. 琼脂糖凝胶电泳：可分离的 DNA 片段大小因胶浓度不同而异，胶浓度为 0.5～0.6% 的凝胶能分离 20bp～50kb 的 DNA 片段。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，可观察的 DNA 条带浓度为纳克级，整个过程一般 1 小时即可完成。该方法操作简便、快速，在基因工程中应用较广。

二、琼脂糖凝胶

1. 低熔点琼脂糖凝胶：用于 DNA 片段回收，凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等操作；
2. 高熔点凝胶：可分离小于 1kb 的 DNA 片段，专用于 PCR 产物分析；
3. 快速凝胶：电泳速度比普通凝胶快一倍，能节省实验时间；
4. 适用于 DNA 大片段分离的凝胶；
5. 其他类型凝胶。

三、DNA 电泳影响因素

1. DNA 分子大小：DNA 分子越大，在胶中的摩擦阻力越大，泳动越慢，迁移速率与线状 DNA 分子质量的对数值成反比。
2. DNA 分子构型：质粒 DNA 分子即便分子量相同，构型不同也会导致电泳时阻力不同，泳动速率存在差异。常规电泳中，质粒 DNA 分子的 3 种构型泳动速率为：超螺旋最快、线状分子次之、开环分子最慢。
3. 胶浓度：同种 DNA 分子在浓度越高的胶中，电泳速率越慢。稀浓度胶的线性范围较宽，浓胶对小分子 DNA 片段的线性关系更优。常规实验中，小片段 DNA 分子用高浓度胶分离（有时用 2％凝胶），大片段用低浓度胶分离。
4. 电场强度：为快速获得实验结果，电泳常用电场强度约为 5V/cm，但分辨率不高。精确测定 DNA 分子大小时，需将电压降至 1V/cm。电场强度偏高会缩小电泳分离的线性范围，电压过高会因电泳产生的大量热量导致 DNA 片段降解。实验中需根据需求选择电压，如分离 DNA 大片段可适当降低电压（Southern 杂交中的 DNA 电泳），避免托尾；小分子 DNA 因在凝胶中快速扩散易导致条带模糊，可选用相对较高电压缩短电泳时间。
5. 溴化乙锭（EB）：电泳常用染色剂，具有扁平结构，能嵌入 DNA 碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小，对超螺旋态分子影响较大。当 DNA 分子中嵌入的 EB 分子逐渐增多，负超螺旋状态分子会向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；EB 分子进一步增加时，DNA 分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，迁移速率又由慢变快。该临界点的游离 EB 质量浓度为 0.1g/ml~0.5g/ml，即电泳时的添加浓度。一般电泳可忽略此因素，特殊电泳可采用电泳后染色消除其影响。
6. 电泳缓冲液：适用于天然双链 DNA 电泳的缓冲液有 3 种，分别是 TAE、TBE 和 TPE。常用 TAE，其电泳时间快、成本低，但缓冲容量低，需经常更换；TBE 缓冲容量大，适合过夜电泳，小片段（<1kb）分离效果好，但回收效率差，不宜用于回收电泳，且磷酸盐在乙醇作用下会析出；TPE 缓冲容量大，适合过夜电泳。

四、DNA 上样缓冲液

1. 螯合 Mg²⁺，防止电泳过程中 DNA 被降解，一般上样缓冲液含 10mmol/L 的 EDTA。
2. 增加样品密度，保证 DNA 沉入加样孔内，通常添加一定浓度的甘油或蔗糖；大片段电泳中采用 Ficoll（聚蔗糖），可减少 DNA 条带的弯曲和托尾现象。
3. 指示剂监测电泳行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳前沿，其速率约与 300bp 的线状双链 DNA 相同。

五、DNA 上样量的控制