小鼠小肠类器官培养Protocol

3.实验仪器、材料

1.仪器：生物安全柜、细胞培养箱、低温水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱、摇床

2.材料：细胞培养板（规格为 24 孔、48 孔和 96 孔）、离心管（规格为 1.5 mL、15 mL 和 50 mL）、细胞培养皿（直径规格为 2.5 cm、6 cm和10 cm）、移液器（规格为 2.5 μL、10 μL、20 μL、200 μL、1000 μL 和 5000 μL）、无菌吸头（规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、无菌镊子、无菌组织剪、70μm细胞过滤器、手术刀片

4.实验试剂

小鼠小肠类器官培养试剂盒、EDTA (0.5M, pH 8.0) 、润洗液、基础培养基、基质胶、DPBS

5.实验内容与方法

1. 实验前准备：

 ➤小鼠小肠类器官培养试剂盒、基质胶4℃化冻

➤小鼠小肠类器官完全培养基的制备：将200μL Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40μL Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x) 加至 9.76mL Mouse Intestinal Organoid Basal Medium 中，充分混合，配制成 10mL 小鼠小肠类器官完全培养基。室温平衡，可在 2-8°C 储存，建议在两周内使用。

➤ 准备足量添加1%双抗的PBS

➤ 准备足量添加0.1%BSA的PBS

➤ 配制5mM EDTA溶液：4mL预冷DPBS溶液加40μL 0.5M EDTA溶液pH8.0，置冰上备用。

2. 取样：小鼠安乐，表面喷洒酒精杀菌。在无菌条件下取出近胃端3~10cm肠组织，用镊子去除肠道外部的肠系膜、脂肪，放入4℃预冷的DPBS溶液中。 

3. 清洗：使用手术剪将肠管剪开，肠腔面朝上，一只手使用手术镊夹住肠组织一端，另一只手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后，将肠组织置于新的含 DPBS 的培养皿中清洗，重复清洗2次。将清洗后的小肠组织剪碎至 2mm 宽，转移至新的培养皿中，用DPBS清洗2遍。

4. 将清洗好的肠段转移至含有 5mmol/L EDTA 的预冷 DPBS 中消化，置于 4℃孵育 30min。

5. 消化完成后，将组织碎片转移到新的含 DPBS 的培养皿中清洗，重复2次以去除 EDTA。

6. 用 5mL 移液管在预冷的0.1%BSA的PBS的培养皿或 50mL 离心管中吹打、重悬组织碎片，使组织反复穿过移液管尖以产生机械剪切力从而使隐窝与基底层分离，取一部分悬液镜检，当可以看到大量的隐窝样结构后，停止吹打，并对吹打后的组织悬液进行 70μm 滤网过滤。

7. 收集穿过滤网的组织悬液，300g 离心力 4℃离心 3min。

8. 弃上清，使用 1mL0.1%BSA的PBS重悬组织沉淀，取 20μL 悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300g 离心力 4℃离心 3min，弃上清后置于冰上。

9. 用适量的 Matrigengel  重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每 10μL Matrigengel  悬液包含 200 至 600 个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30s 以避免 Matrigengel  过早凝固。

注意：Matrigengel  稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中 Matrigengel  的结构稳定性。

10. 将 Matrigengel  和组织细胞的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，每孔 30μL 左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止 Matrigengel  室温凝固，此步骤应尽快完成。

11. 将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 15min 左右待 Matrigengel  凝固。

12. 待 Matrigengel  完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠小肠类器官完全培养基，24 孔板每孔 500uL，避免破坏已凝固结构。

13. 将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。

14. 每 3 天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏 Matrigengel 。

15. 密切监测类器官生长状态，理想情况下，小鼠小肠类器官应在 5 至 7 天内建成。