血管形成实验——熟练篇

技巧一：判断是否加入合适体积的基质胶？

将孔板下面放置一张格子纸（如图），垂直透过每个孔观察下面的格子纸：

（1）如果观察到的格子比实际尺寸小，判断基质胶加入体积不足；

（2）如果观察到的格子比实际尺寸大，判断基质胶加入体积过多；

（3）如果观察到的格子与实际尺寸一致，判断基质胶加入体积合适。

2. 为什么我铺的基质胶液面总是不平？或者有气泡？

a) 收货时确保基质胶是固态，并在干冰中储存，收货后基质胶储存在-20℃。储存方式不当可能导致基质胶的质量受损，容易使胶面不平及产生气泡。

b) 基质胶应置于碎冰上并4℃过夜融化，确保所有操作在冰上进行。高温可能加速胶凝固，导致胶面不平及产生气泡。

c) 向孔板中加基质胶前使用涡旋振荡的方式保证胶液处于均匀的状态，如果胶浓度高可考虑做适当稀释。

d) 向孔板中加基质胶时尽可能垂直加入，避免气泡产生。

技巧二：刚加胶时出现明显的气泡，可使用吸头轻触戳破。

3.为什么我的成管实验中细胞不能形成连续的网格？

a) 建议使用3-5代状态较好且融合度70%-80%的HUVEC细胞进行成管试验，此时细胞成管能力比较强。

b) 在使用胰酶消化细胞时，在显微镜下边观察边消化，当细胞变圆时及时终止消化过程。消化过度会影响成管。

c) 尽可能保证细胞数量为约3万个/孔，细胞数量过少会使细胞无法形成连续的网络。

d) 选择低生长因子基质胶进行成管实验时，可考虑在培养基中添加生长因子刺激细胞成管。

技巧三：由于计数方式的差异可能导致细胞数量的差异，可进行预实验测试合适的细胞数铺板，细胞静置后镜下观察如下图数量比较适宜。

4.成管实验到底需要几个小时？6个小时？20个小时？小管形成后有塌缩了？

a) 成管时间与细胞状态密切相关。细胞状态好时，2-3小时开始成管，细胞状态较差时，可能18-24h成管。建议第一次实验时，每4个小时观察一次。

b) 成管时间取决于培养基中血管生成因子的浓度，肿瘤条件培养基中血管生成因子较丰富，容易成管，而基础培养基成管时间较久。

c) 如果使用原代内皮细胞而非永生化细胞，开始成管的时间会延迟几个小时。

d) 小管形成后有塌缩:可能是培养时间过久，内皮细胞发生凋亡导致。

5.其他注意事项：

a) HUVEC细胞容易沉底，易使孔间细胞数量不一致，细胞数量不一致会影响成管结果，数量多的孔容易成管。每孔加样前需用移液器吹打混匀。

b) 基质胶浓度高时，移液器吸入的体积可能不准，可用无菌剪剪去枪头前端后再去吸入基质胶。

c) 实验前一天无血清饥饿细胞，第二天成管效果会更好。