诱导多能干细胞培养方案

一、培养材料

1. 试剂：ABW® Matrigengel (REF: 082775)；ROCK 抑制剂（Y-27632）；DMEM F12/DMEM；mTeSR1/E8 培养基；Accutase 解离剂；PBS (D-PBS)
2. 耗材：无菌枪头；六孔板；无菌 EP 管

二、培养准备

1. 材料预冷：

    

   a. 将 ABW® Matrigengel 置于冰盒中，放入 4℃冰箱，使胶能过缓慢融化；

    

   b. 4℃预冷无菌离心管、无菌枪头、六孔板、DMEM F12/DMEM；
2. 将 ABW® Matrigengel (REF: 082775) 以 1:80 或 1: 100 比例进行稀释：

    

   a. 将适量 4℃的 DMEM F12/DMEM 移入冷却的 15/50 mL EP 中；

    

   b. 使用移液器将预冷的枪头从 EP 管吸取 DMEM F12/DMEM 中移入分装好的 ABW® Matrigengel，再吸取转移至 EP 管内；重复几次，直到基质胶完全移入到 EP 管中；

    

   c. 按比例混合后作为铺基基质胶混合液，进行后续铺板；
3. 制作基质胶涂层：

    

   a. 按 1mL / 孔将基质胶混合液加入预冷的六孔板中，轻轻晃动以确保混合液均匀铺在板上；

    

   b. 将 6 孔板转移到 37℃孵育过夜（板材可以在孵育四小时后即可使用，但过夜孵育的涂层对细胞培养效果更佳）；

    

   c. 使用前吸去涂层上方液体；
4. 配置 ROCK 抑制剂（Y-27632）工作液：使用无菌 PBS 将 Y-27632 溶解，配置成 10mM 溶液（1000X），工作浓度为 10μM；
5. 配置含 ROCK 抑制剂 mTeSR1/E8 培养基：将 10mM 溶液加入 mTeSR1/E8 培养基至终浓度为 10μM。

三、细胞培养

1. 复苏 iPSC：
    
   a. 从液氮罐或干冰中取出 ipsc，37℃水浴中解冻，解冻应迅速完成；
    
   b. 用 75% 酒精消毒冻存管后转移到超净台 / 生物安全柜；
    
   c. 将细胞溶液转移到新的 15ml EP 管中，用 DMEM F12/DMEM 冲洗冻存管两次；
    
   d. 室温 300g 离心 5min (ipsc 对于 200-300g 的转速都有较好的耐受性，建议使用 300g 来最大限度捕捉细胞，标准程序下建议使用 200g)；
    
   e. 弃上清，用 2mL 含有 ROCK 抑制剂的培养基轻轻地重悬 iPSC 后转移到用新铺好的孔中，前后摆动使得细胞均匀分布（建议将每瓶细胞 1*10^6 装在六孔板的一个孔内使细胞存活率最大化）；
    
   f. 将六孔板放回 37℃培养箱。（请在细胞被转移后立即执行，避免细胞中央密度增加）；
    
   g. 次日撤去 ROCK 抑制剂，即用无抑制剂的培养基替代含抑制剂的培养基培养细胞。

2. iPSC 传代：
    
   a. 将培养上清吸去，用 1mL 的 PBS 清洗后加入 1mL Accutase；
    
   b. 转移到 37℃培养 3 分钟，或在显微镜下观察到大部分细胞脱落（若细胞仍然附着，可将培养板放在手上，另一手轻轻在你的手上拍打使板发生轻微震动从而使细胞脱落）；
    
   c. 传代前准备好基质胶涂布的六孔板；
    
   d. 倾斜培养板，将 Accutase 溶液沿培养层表面转移两次，分离色块并转移到离心管中；
    
   e. 用 DMEM F12/DMEM 冲洗培养层表面，并与管中的细胞溶液合并（使用 DMEM/F12 或用 PBS 洗涤，建议使用至少 5% 的培养基，有利于随后的洗涤和附着）；
    
   f. 室温下 300g 离心五分钟；
    
   g. 吸去上清，用含有 ROCK 抑制剂的培养基进行重悬；
    
   h. 将细胞加入到涂层板中，轻轻摇动使细胞分布均匀；
    
   i. 将培养板放入 37℃培养箱中孵育。

3. iPSC 细胞冻存：
    
   a. 准备细胞和解离液，在解离液解离细胞过程中，将培养基与 10% DMSO 混合，在冻存管上贴好标签，配置好冻存液（可选 20% 血清或血清替代物提高存活率，也可以使用 90% 胎牛血清 + 10% DMSO）；
    
   b. 分离细胞方法同传代，可以使用细胞计数器来配合进行细胞的冻存；
    
   c. 以 1×10^6 冻存每管细胞，之后进行离心、抽吸培养基，然后在适当体积的冻存液中进行重悬；
    
   d. 将 1ml 重悬好的细胞冻存液加到 1.5ml 冻存管中，并进行程序性降温，在液氮罐中长期保存。